0 引言 Introduction

临床工作中发现半月板损伤是最常见的关节内损伤之一[1]，作为一种具有异质性结构的高度致密结缔组织，半月板内侧区域由于缺乏血供和高度分化的组织类型损伤后难以实现自我愈合[2-3]，损伤后的半月板可造成关节整体负重结构改变，进而导致相邻关节软骨损伤，最终诱发骨性关节炎[4]。对于半月板内侧无血供区的损伤，目前的外科治疗途径例如半月板的完全或部分切除治疗效果有限且明显增加了骨性关节炎的发生风险[5]，其他治疗方法包括半月板异体移植等都存在着诸多局限性，难以实现组织的功能再生[6]。近年来研究者们提出原位组织工程再生理念，将生物材料直接植入组织缺损处，利用相关药物或招募性因子来实现对周围组织内的内源性细胞尤其是干细胞的募集，实现组织修复与再生[7-8]。因此，实现支架材料的精细设计以提供机械支撑，招募特定细胞进入支架材料内并使其黏附生长，成为原位组织工程技术再生修复半月板损伤的研究重点。

近些年来兴起的3D 生物打印技术适于应用在组织工程相关领域，该技术具有高度自动化和精细控制的优势，可依据自体组织结构进行仿生设计并最终通过精确打印生物活性分子与细胞负载生物材料等构建相应人工组织[9]。3D 生物打印的一个突出优势是其对于生物材料的精密结构设计和制备能力[10]。在合成材料方面，以往研究已证实，基于聚己内酯[poly(ε-caprolactone)，PCL]材料的3D 打印支架具有优良的力学性能、可降解性和生物相容性[11-12]，可作为组织工程半月板支架的理想骨架材料，然而PCL 材料也具有疏水性和细胞附着性差等缺点[13-14]。考虑到目前组织工程领域广泛应用的甲基丙烯酸酯化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)具有的可打印性、生物相容性好、无细胞毒性和降解性等特点，可将其作为3D 生物打印的生物墨水基础材料[15]。尽管GelMA材料具有诸多优势，但仍无法充分模拟半月板的天然细胞外基质微环境。大量研究表明，去除了细胞成分的细胞外基质内含多种有效成分，可以为募集来的种子细胞提供理想微环境[16]。GelMA 和半月板细胞外基质(meniscus extracellular matrix，MECM)结合而成的3D 打印用生物墨水有望充分促进细胞的黏附生长和细胞外基质的沉积。另一方面，血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)作为一种对于软骨细胞和间充质干细胞具有强烈趋化作用的生长因子，可以通过结合并激活血小板直接生长因子受体产生促细胞增殖和细胞外基质产生的生理作用，在半月板损伤再生领域有一定应用潜力[17]。以往已有研究报道，利用PDGF-BB 与肝素的静电作用使其负载于脱细胞半月板支架之上，该支架可以缓慢释放PDGF-BB，并可以通过募集周围的组织细胞产生良好的修复效果[18]。

实验通过建立3D 生物打印PCL/GelMA/MECM 的半月板支架制备流程，负载PDGF-BB 于GelMA/MECM 生物墨水之中成功一体化打印生物活性支架，通过体外实验检测其微观结构、力学性能及生长因子的缓释性能，同时着重探究其对于滑膜间充质干细胞迁移性和增殖性调控的作用，期望在原位组织工程技术再生修复半月板损伤领域提供更多理论依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年9 月至 2020 年6 月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料 PCL 与GelMA 材料的理化性能，见表1；脱细胞MECM 由课题组制备。

表1 ｜聚己内酯与甲基丙烯酸酯化明胶材料的理化性能Table 1 ｜Physical and chemical properties of poly(ε-caprolactone) and gelatin methacryloyl

1.3.1 实验动物 4 周龄新西兰大白兔4 只，雌雄不拘，体质量约1 kg，购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0015。实验方案经中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。

1.3.2 实验主要试剂及仪器 PDGF-BB(近岸蛋白质科技有限公司，中国)；Transwell 小室、胎牛血清、DMEM/F12 培养基(Corning 公司，美国)；结晶紫(Sigma-Aldrich 公司，美国)；酶联免疫吸附试剂盒(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA，RayBiotech 公司，美国)；CCK-8 试剂盒(同仁公司，日本)；SUNP BIOMAKER 生物打印机(上普博源生物科技有限公司，中国)；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800 型，日本)；CMT5304-30KN 型微机控制电子万能试验机(深圳三思科技有限公司，中国)；EZ-LX 型单柱式电子万能试验机(岛津公司，日本)；EPOCH TAKE 3 酶标仪(Bio Tek 公司，美国)；TCS SP8共聚焦显微镜(Leica 公司，德国)。