0 引言 Introduction

骨缺损的修复是影响人类生命和健康的重大医学难题，目前临床上常用的骨缺损修复材料有自体骨、生物瓷、高分子材料等[1]，但这些材料并不能满足目前的临床需求。组织工程骨技术的出现为临床骨缺损的修复带来了新的契机。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是最常用的组织工程种子细胞，具有良好的多向分化潜能和自我更新能力，可分化为骨、软骨及脂肪细胞等多种细胞类型[2]。现如今细胞膜片技术已在组织工程领域广泛应用，是进行组织修复和改善器官功能的良好移植物[3]，因其避免了胰酶的消化作用，并且与细胞悬液注射相比可以保留更多的细胞数目和更高的细胞存活率[4]，因此在组织工程骨研究中细胞膜片已成为基于支架材料的有效传递种子细胞的主流方法，可发挥干细胞的绝对优势。课题组已具备干细胞膜片培养相关技术，可以成功实现干细胞膜片的培养与构建，结合支架材料的体内外实验验证了骨形态发生蛋白2 与碱性成纤维细胞生长因子2 联合应用时可促进BMMSCs 膜片的增殖及其成骨诱导能力[5]。基于细胞膜片技术以上的优越性能，其在组织工程研究中显示了良好的应用前景。

近年来，利用微小RNA(microRNA，miRNA)调节干细胞的功能和分化是再生医学的一个极具吸引力的治疗模式[6]，它通过与靶标3'UTR 区结合致使信使RNA 降解或抑制编码蛋白表达来发挥调控作用[7]。有文献报道，过表达miR-378a的人BMMCs 具有较明显的成骨及成血管耦合能力，可作为骨再生基因治疗的潜在工具[8]。然而，miRNA 在体内易降解且不能轻易穿过细胞膜，通常需要载体进行保护并递送到细胞中[9-10]。已有学者验证了非病毒性载体递送miRNA 的可行性，并发现由非病毒载体递送的miRNA 对BMMSCs 膜片的成骨具有促进作用[11]，此方式虽简单快捷，但并不具备较高的效率和长期表达的优势。因此，探索一种将miR-378a 整合至BMMSCs 膜片的高效稳定的递送方法，以进一步增强BMMSCs 膜片的成骨及成血管分化能力具有重要意义。

实验选用载有过表达miR-378a 的慢病毒修饰BMMSCs，通过细胞膜片技术将BMMSCs 诱导成膜片进行成骨分化诱导实验，验证过表达miR-378a 慢病毒载体递送至BMMSCs膜片的可行性，并探讨体外成骨分化过程中miR-378a对BMMSCs 膜片成骨及成血管分化能力的影响，为寻求一种新型的骨缺损修复方式提供参考。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年10 月至2020 年7 月在新疆医科大学第一附属医院感染与免疫实验室及干细胞研究实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠20 只，体质量30-50 g，3周龄，雌雄不拘，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(新)2016-0003。实验经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准(动物伦理审核项目编号：IACUC-04)。

1.3.2 实验试剂和仪器 MEM 培养基(gibco，中国)；胎牛血清(Bioligical Industries，以色列)；LV-rno-miR-378a 慢病毒载体、阴性对照病毒(CON137，hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRESpuromycin)购于上海吉凯基因有限公司；miRNA 反转录及定量试剂盒(GenePharma，上海)；荧光定量试剂盒(QIAGEN，德国)；增强型CCK-8(Bioss，北京)；反转录试剂盒(Takara，日本)；Western bolt 相关试剂盒(武汉博士德)；RT-PCR 仪(Bio-RAD，美国)；倒置相差显微镜(莱卡，德国)；共聚焦显微镜(LASAF-CIP-HWS3LEICA，德国)；酶标仪(Thermo，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 BMMSCs 的分离、培养及鉴定 SD 大鼠脱颈处死后，用体积分数75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下取出肱骨、股骨及胫骨，采用全骨髓培养法：使用5 mL 注射器吸取含体积分数15%胎牛血清、1%双抗及谷氨酰胺的MEM 培养基冲出骨段中的骨髓，至骨段变白，反复吹打后将骨髓溶液转移至培养瓶中，放置在 37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱。3 d 后首次换液，以后隔天换液。PBS 冲洗除去未贴壁细胞，待细胞生长融合80%-90%时加0.25%胰酶消化传代，按1 ∶2比例传代，共传 2 代。培养至第3 代进行体外细胞学实验。流式细胞术检测BMMSCs 表面标志物 CD29 和CD45 表达情况。

1.4.2 慢病毒转染BMMSCs 过表达miR-378a 慢病毒载体(LV-rno-miR-378a)及阴性对照病毒载体由上海吉凯基因有限公司构建并确定滴度。慢病毒载体自带EGFP 荧光标记物。

取生长良好的第3 代BMMSCs，胰酶消化离心后重悬，按细胞浓度3×108L-1接种于6 孔板，达50%-60%融合后，按预实验感染复数MOI 值=20 加入相应病毒量，实验分组：转染过表达miR-378a 慢病毒载体+感染增强液P 为LV-miR-378a-BMMSCs 组，转染阴性对照慢病毒载体+感染增强液P 为LV-BMMSCs 组，未转染慢病毒的细胞作为空白组。转染液体量每孔1 mL，小幅水平震荡混匀，放培养箱培养，12 h 后更换为完全培养基，每孔2 mL，以后每2 d 换液一次，72 h 后于荧光显微镜下观察。