0 引言 Introduction

软骨损伤的治疗对骨科医生来说是一个挑战[1]。在最近的几十年中，组织工程的发展为软骨损伤提供了一些新的治疗方法[2-5]。细胞治疗是组织工程的重要组成部分，间充质干细胞为组织再生提供了巨大潜力[6-7]。脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)作为一种间充质干细胞在促进软骨再生方面有着积极作用[8]，有文献将其简称为脂肪干细胞[9]。ADSCs 的获取要比骨髓干细胞和软骨细胞容易，损伤较低且来源丰富[10]，因此ADSCs 具有更大的临床价值。然而，传统的平板细胞生长容易引起接触抑制，并且将细胞移植到受损区域后缺乏载体支持很容易导致细胞的丢失。将细胞嵌入微球可以避免此问题[11]，微球的应用在软骨组织工程领域取得了长足进步[12-13]，微球具有独特的优势，例如为细胞生长提供适当的微环境；此外，由于微球直径为微米级别[14]，因此可以通过注射微创地达到关节软骨缺损区域。

含细胞微球应用广泛[15]，微球可作为细胞递送系统，通过注射或者与其他支架相结合的方式使细胞定位于软骨损伤处使其再生[16]。目前微球的制备方法大多采用化学乳化法，化学乳化法需添加化学有机溶剂进行多步骤操作，这将存在化学有机溶剂残留的风险[11]。高压静电场喷雾法制备微球技术是通过高压电使针内液体带电，由于静电力使液滴分散为微滴喷雾至交联液体中成球，而且更重要的是无需添加化学有机活性剂，相比于乳化法更安全、高效、简便。

藻酸盐微球已有报道可用于组织再生[17]。海藻酸盐是一种多糖，其结构类似于天然软骨的细胞外基质[18]，但主要缺点是它对细胞增殖和黏附的支持能力较差[19]。这些缺点可以通过添加明胶来解决[20]，然而目前对于加入明胶成分的海藻酸盐微球研究较少，而且缺乏ADSCs 在含有明胶成分的微球中是否能够有效增殖的研究。于是，实验提取了SD 大鼠的ADSCs，采用电喷雾法将ADSCs 负载至海藻酸盐-明胶微球中，对微球形态、细胞活性及其增殖和成软骨分化能力进行评估。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年6 月至2020 年8 月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 主要试剂和仪器 明胶(Type B)、海藻酸钠(Sigma，美国)；DMEM、FBS、Ⅰ型胶原酶(GIBCO，美国)；软骨分化完全培养基(Cyagen，美国)；电喷雾装置(Nisco，瑞士)；流式检测抗体CD31、CD34、CD45、CD29 (BD，美国)；Live/Dead 细胞死活染色试剂盒(Life Technologies，美国)；旋转细胞培养系统(RCCS，Synthecon，美国)；组织糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒(Genmed 美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)。

1.3.2 实验动物 SD 大鼠5 只，雌雄不拘，体质量180-220 g，购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2016-0002。

1.4 实验方法

1.4.1 ADSCs 的提取 通过先前报道的方法从大鼠脂肪组织提取ADSCs[21]。简而言之，取SD 大鼠腹股沟的脂肪组织并切碎，PBS 冲洗，37 ℃下用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化；使用70-μm尼龙网过滤细胞悬液，然后将体积分数10%胎牛血清添加到培养基中，以便对含有胶原酶的细胞悬液进行中和，然后以800×g离心5 min；通过无菌移液管吹打离心后的细胞团进行重悬，紧接着使用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM 对细胞进行培养。每2 d 换液一次，至细胞融合至 80% 左右进行常规细胞传代。传至第 3 代ADSCs 备用。

1.4.2 ADSCs 的流式细胞术鉴定 将P3 代ADSCs 结合抗体CD31、CD34、CD45 和CD29 分析特定的表面标记物。具体来说，将106细胞重悬于50 μL PBS 的流式管中，每个流式管分别加入1 μg 抗体，并在室温下于黑暗中孵育15 min。然后将其加入2 mL PBS 中，400×g离心5min。丢弃上清液后，加入500 μL PBS 进行分析，通过流式细胞仪分析所有样品。

1.4.3 ADSCs 的诱导分化能力 在体外使用三系诱导的方法分析ADSCs 的诱导分化能力。对于脂肪方向分化培养基，将20 mL 的FBS、2 mL 的青霉素-链霉素、2 mL 的谷氨酰胺、400 μL 的胰岛素、200 μL 的地塞米松、200 μL 的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤添加到175 mL 的高糖DMEM 中。对于成骨分化培养基，向175 mL DMEM 中加入2 mL 的β-甘油磷酸、20 μL 的地塞米松和400 μL 的抗坏血酸。对于软骨形成的分化，使用了微团培养技术，将4×105细胞放入15 mL 离心管中进行离心沉淀，然后添加软骨分化完全培养基，36 h 后在离心管底部出现细胞簇，轻拂离心管底部，使软骨球悬浮在培养基中，然后每3 d 更新成软骨分化培养液。在37 ℃和体积分数5%CO2的环境下，用上述3 种培养基诱导ADSCs 分化21 d，成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分别进行茜素红、油红O、阿尔辛蓝染色。